Calculadora de Cobertura

La calculadora de cobertura es una herramienta esencial para investigadores que diseñan bibliotecas de oligonucleótidos, especialmente en aplicaciones de CRISPR, tiling arrays, síntesis de genes y secuenciación dirigida. Esta herramienta determina el número mínimo de oligonucleótidos necesarios para cubrir completamente una región objetivo del genoma o secuencia, considerando diferentes estrategias de diseño y parámetros de solapamiento o espaciado.

Oligonucleótidos Requeridos: Este número indica el mínimo de oligonucleótidos necesarios para alcanzar la cobertura deseada según los parámetros especificados. Este es un valor mínimo teórico; en la práctica, es posible que necesite algunos oligonucleótidos adicionales para compensar restricciones de diseño (como evitar secuencias repetitivas o estructuras secundarias problemáticas). Para presupuestos y planificación, considere agregar un margen del 10-20% sobre este número mínimo.

Cobertura Real: Este porcentaje indica qué proporción de la región objetivo está efectivamente cubierta por los oligonucleótidos. Una cobertura del 100% significa que cada posición está cubierta al menos una vez. Si la cobertura es menor al 100%, hay regiones sin cobertura (gaps) que deben abordarse. Para aplicaciones críticas como síntesis de genes o análisis completos, se requiere cobertura del 100%. Para aplicaciones donde algunos gaps son aceptables (como screening inicial), una cobertura del 95-99% puede ser suficiente.

Redundancia Promedio: Este valor indica cuántas veces en promedio cada posición está cubierta por oligonucleótidos. Una redundancia de 1x significa cobertura única, mientras que valores mayores indican múltiples coberturas. Mayor redundancia proporciona mayor robustez contra errores de síntesis o problemas de hibridación, pero aumenta el costo y la complejidad. Para la mayoría de aplicaciones, una redundancia de 1-2x es óptima. Valores muy altos (>5x) generalmente no son necesarios y pueden ser costosos.

Regiones sin Cobertura (Gaps): Estas son áreas de la secuencia objetivo que no están cubiertas por ningún oligonucleótido. Los gaps pueden ocurrir debido a restricciones de diseño (como en CRISPR donde solo se pueden usar sitios PAM válidos), espaciado insuficiente, o parámetros subóptimos. Si hay gaps, revise el mapa de cobertura para identificar su ubicación y considere ajustar los parámetros (aumentar solapamiento, reducir espaciado, o aumentar redundancia) para eliminarlos. Para aplicaciones críticas, los gaps deben eliminarse completamente.

Mapa de Cobertura: El gráfico visual muestra la cobertura a lo largo de la región objetivo. Las áreas con alta cobertura aparecen como picos en el gráfico, mientras que las áreas con baja cobertura o gaps aparecen como valles o líneas planas en cero. Use este mapa para identificar regiones problemáticas y ajustar su diseño en consecuencia. Un mapa uniforme indica cobertura equilibrada, mientras que un mapa irregular puede indicar problemas de diseño o distribución desigual de sitios válidos.

Consideraciones por Aplicación: Los requisitos de cobertura varían según la aplicación. Para CRISPR, los gaps pueden ser aceptables si están en regiones no críticas, pero idealmente se debe maximizar la cobertura. Para tiling arrays, se requiere cobertura completa y uniforme sin gaps. Para síntesis de genes, se necesita cobertura completa con suficiente solapamiento para el ensamblaje. Para secuenciación dirigida, la cobertura debe ser completa pero la redundancia puede variar según la profundidad de secuenciación deseada.

La calculadora de cobertura implementa algoritmos matemáticos validados científicamente para determinar el número mínimo de oligonucleótidos necesarios para cubrir una región objetivo. Para la estrategia Tiling con solapamiento, el cálculo utiliza la fórmula base: Número base de oligos = (Tamaño objetivo - Longitud oligo) / (Longitud oligo - Solapamiento) + 1. Para lograr la redundancia deseada, se multiplica por el factor de redundancia: Número total de oligos = Número base × Redundancia. Esta fórmula asegura que cada posición esté cubierta al menos el número de veces especificado por la redundancia, considerando el solapamiento entre oligonucleótidos adyacentes. El método está basado en principios de geometría combinatoria y ha sido ampliamente utilizado en diseño de arrays y síntesis de genes desde la década de 2000.

Para la estrategia CRISPR con sitios PAM, el cálculo considera la densidad de sitios PAM válidos en la secuencia. La densidad de sitios PAM depende del sistema CRISPR utilizado: para SpCas9 con sitios NGG, la densidad teórica es aproximadamente 1/16 (0.0625), pero en la práctica puede variar según la composición de la secuencia. Nota importante: Este cálculo es una estimación teórica que asume una distribución uniforme de sitios PAM. El algoritmo implementado: (1) calcula el número teórico de sitios PAM basado en la densidad, (2) simula la distribución uniforme de estos sitios, (3) filtra los sitios según el espaciado mínimo requerido entre gRNAs, y (4) aplica el factor de redundancia. La fórmula resultante es: Número de oligos = Sitios PAM seleccionados × Redundancia, donde los sitios PAM seleccionados son aquellos que cumplen con el requisito de espaciado mínimo. Los métodos actualizados incorporan restricciones adicionales como evitar sitios PAM en regiones repetitivas o con baja especificidad, basándose en las mejores prácticas establecidas por Doench et al. (2016) y estudios posteriores.

Para la estrategia Espaciado personalizado, el cálculo utiliza: Número base de oligos = ceil(Tamaño objetivo / Espaciado), y luego se aplica el factor de redundancia: Número total de oligos = Número base × Redundancia. Este método permite control preciso del espaciado pero puede resultar en gaps si el espaciado es demasiado grande en relación con la longitud del oligonucleótido. Para evitar gaps, el espaciado debe ser menor que la longitud del oligonucleótido, creando solapamiento natural.

El cálculo de redundancia de cobertura utiliza algoritmos de ventana deslizante para determinar cuántas veces cada posición está cubierta por oligonucleótidos. El algoritmo simula la colocación de oligonucleótidos a lo largo de la región objetivo según la estrategia seleccionada y cuenta las coberturas en cada posición. La redundancia promedio se calcula como la suma de todas las coberturas dividida por el tamaño del objetivo. El algoritmo también identifica gaps (regiones con cobertura cero) y calcula su longitud y ubicación.

Estos métodos han sido refinados y optimizados basándose en retroalimentación de la comunidad científica y validación experimental. Las mejoras recientes incluyen mejor manejo de casos límite (como regiones muy pequeñas o muy grandes), optimización computacional para cálculos rápidos incluso con regiones grandes, y actualización de parámetros por defecto basados en datos empíricos más recientes. La herramienta está diseñada para ser compatible con los estándares y mejores prácticas actuales de la industria, incluyendo las recomendaciones de la comunidad CRISPR y las mejores prácticas para diseño de arrays.